病毒灭活效果验证测试方法

病毒保存液有两种类型，一种是改良型裂解病毒蛋白提取核酸的灭活型保存液，一种是以运送培养基为基础改良的维持病毒体外活性、其核酸及抗原完整性的非灭活型保存液。常用的是灭活型保存液，高效灭活病毒，可以防止二次感染。咨询电话: 13816144967 (微信同号)

实验标准：

参考《消毒技术规范》（2002版）病毒灭活试验中描述的检测方法，确定病毒保存管灭活能力。

实验方法：

1. 细胞培养

将生长状态良好的HEK293T细胞消化计数后稀释至1×104/mL，按照100μL/孔的体积，每个梯度的病毒做三个复孔，计算所需接种孔数，将细胞缓慢均匀接种至96孔板中。放入37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。

2. 病毒稀释

将病毒滴度为107-108TU/mL的病毒按10倍梯度进行稀释，连续稀释3个梯度。咨询电话: 13816144967 (微信同号)

3. 病毒灭活

把稀释好的病毒置于室温条件下，与灭活款病毒保存液按1:1体积比进行混合，置于室温下分别放置1min、5min和10 min进行灭活。

4. 终止灭活

采用病毒分离培养基（可用DMEM完全培养基替代）进行1000倍稀释以中和灭活保存液，终止灭活。

阴性对照：为病毒分离培养基对灭活款病毒保存液稀释1000倍的混合液；

阳性对照：为病毒分离培养基对病毒原液稀释1000倍的混合液。

5. 病毒孵育

将事先培养的HEK293T细胞中吸弃细胞培养基，每孔加入100μL准备好的病毒混合液，和对应的阳性对照、阴性对照。病毒孵育3小时，每隔30分钟从培养箱中取出晃动一次。

6. 细胞培养

孵育结束后，将病毒液吸去，每孔中加入100μL DMEM完全培养基，将96孔板置于37℃，5% CO2培养箱中培养，并观察细胞状态。

7. 荧光细胞观察与计数

继续培养48-72h，期间观察细胞状态，若细胞培养液变黄，应换液，对荧光细胞个数适量的孔进行计数，计算病毒滴度。咨询电话: 13816144967 (微信同号)