病毒灭活效果验证测试方法
病毒保存液有两种类型,一种是改良型裂解病毒蛋白提取核酸的灭活型保存液,一种是以运送培养基为基础改良的维持病毒体外活性、其核酸及抗原完整性的非灭活型保存液。常用的是灭活型保存液,高效灭活病毒,可以防止二次感染。咨询电话: 13816144967 (微信同号)
实验标准:
参考《消毒技术规范》(2002版)病毒灭活试验中描述的检测方法,确定病毒保存管灭活能力。
实验方法:
1. 细胞培养
将生长状态良好的HEK293T细胞消化计数后稀释至1×104/mL,按照100μL/孔的体积,每个梯度的病毒做三个复孔,计算所需接种孔数,将细胞缓慢均匀接种至96孔板中。放入37℃,5%CO2培养箱中培养过夜。
2. 病毒稀释
将病毒滴度为107-108TU/mL的病毒按10倍梯度进行稀释,连续稀释3个梯度。咨询电话: 13816144967 (微信同号)
3. 病毒灭活
把稀释好的病毒置于室温条件下,与灭活款病毒保存液按1:1体积比进行混合,置于室温下分别放置1min、5min和10 min进行灭活。
4. 终止灭活
采用病毒分离培养基(可用DMEM完全培养基替代)进行1000倍稀释以中和灭活保存液,终止灭活。
阴性对照:为病毒分离培养基对灭活款病毒保存液稀释1000倍的混合液;
阳性对照:为病毒分离培养基对病毒原液稀释1000倍的混合液。
5. 病毒孵育
将事先培养的HEK293T细胞中吸弃细胞培养基,每孔加入100μL准备好的病毒混合液,和对应的阳性对照、阴性对照。病毒孵育3小时,每隔30分钟从培养箱中取出晃动一次。
6. 细胞培养
孵育结束后,将病毒液吸去,每孔中加入100μL DMEM完全培养基,将96孔板置于37℃,5% CO2培养箱中培养,并观察细胞状态。
7. 荧光细胞观察与计数
继续培养48-72h,期间观察细胞状态,若细胞培养液变黄,应换液,对荧光细胞个数适量的孔进行计数,计算病毒滴度。咨询电话: 13816144967 (微信同号)