病毒灭活试验

病毒,一类严格的细胞内寄生物。在宿主细胞外环境，病毒既不能独立进行代谢活动，也不能进行繁殖，只能以颗粒形态存在，即病毒体(virion)的形态存在。病毒死亡，由蛋白质外壳的分裂和核酸退化导致的病毒浓度随时间的降低。死亡的病毒不会感染宿主细胞, 因而丧失对人畜健康危害（没有生物活性，不能主动进入细胞，也不能在细胞内进行复制）。清除病毒的方法有很多，按病毒去除/灭活方式的不同，可分为有机溶剂/去污剂(S/D)法、低pH值孵放法、膜过滤法、紫外法、超短时微波加热法、巴氏消毒法和干热法等。咨询电话: 13816144967 (微信同号)

1. 有机溶剂/去污剂病毒（S/D）灭活法

过去，人们发现甲肝病毒能通过消化道传播，乙肝病毒通常不能通过消化道传播，但是在胆汁分泌障碍人群体内，乙肝病毒能通过消化道传播的概率较高。后来，科学研究发现，这与胆汁能溶解乙肝病毒的脂包膜有关。根据以上原理，通过研究和临床观察发现，使用Triton-X 45这类的非离子型表面活性剂（去污剂）和磷酸三丁酯（有机溶剂）能够有效破坏类似乙肝病毒的类脂膜：类脂从病毒表面脱落，使病毒失去黏附和感染细胞的能力，从而达到灭活病毒的效果，且对蛋白质分子的结构的影响也非常小。这种方法就是有机溶剂/去污剂病毒（S/D）灭活法。

因S/D法具有较高病毒去除作用、蛋白相容性高、易于插入到现有或新开发的纯化工艺中等优点，人们便将这种灭毒方法用于血浆、血液制品和生物制品。S/D法作为血浆病原体灭活技术，是最早得到医疗界的认可，并投入临床中的。因为S/D法满足了以下三点：①能完全有效灭活胞内、胞外病原体及附着在细胞上的病原体；②所选试剂能选择性地进入细胞且不损伤细胞；③经处理后的红细胞不产生新抗原或者抗体，对人体无害。因为S/D病毒灭活处理对多种不同的包膜病毒都能发挥有效的病毒灭活作用,且有良好的临床安全性，因此其通过美国FDA许可,以用于浓缩的人血液Ⅷ因子的病毒灭活,并已广泛用于生物制品的生产。

在工艺操作过程中需要注意：本方法对于无脂包膜类病毒作用微弱（仅部分非脂包膜病毒有效），但在工艺中的低pH（如pH 4）处理（有时加胃酶）能灭活几种脂包膜病毒。除此之外，病毒灭活效果可能受pH值、孵放时间和温度、胃酶含量、蛋白质浓度、溶质含量等因素影响。随着pH升高，灭活效果降低，随着温度升高，灭活效果升高，通常可以达到5~6LRV灭活效果。在pH 3.7、pH 3.8时，其灭活效果会受多因素干扰。而样品中含有一定量的精氨酸时可以改善病毒灭活效果，即使在pH 4.0的条件下也有显著的灭活效果。低pH孵放不仅可以灭活有脂包膜类病毒，还可以沉淀HCP、DNA等杂质，对纯化工艺中的杂质去除也起到重要作用。咨询电话: 13816144967 (微信同号)

2. 纳米膜过滤技术

纳米膜过滤技术是一种通过孔径大小过滤来滤除病毒的技术，多用于血液制品和生物制品中的病毒去除，其可以有效去除非脂包膜病毒。作为生物制品净化过程中最常用的技术之一，其目的是达到有效的净化效果，保证生物制品的安全。得益于生物治疗产品如单克隆抗体、干细胞产品、血液成分、生物制剂和疫苗不断增长的需求，未来几年全球病毒过滤市场预计呈现增长的趋势。

纳米膜过滤是利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔径的蛋白通过滤膜，大于平均孔径的病毒截留在膜内，从而达到去除病毒的效果。纳米膜过滤可以同时满足病毒去除效果好、目的蛋白质通过性高（回收量、过滤时间）、目的蛋白质不变性的特点，另外不管是脂包膜病毒还是非脂包膜病毒，无论病毒基因组是RNA还是DNA，基本靠孔径大小来去除病毒，所以是当前最可靠的病毒去除、灭活技术。根据目的蛋白的大小，可以选择平均孔径不同的滤膜。在滤过产品中，平均孔径为20 nm左右的产品被称为细小病毒滤膜。近年来，由于去除小病毒的需求的提高，这种产品得到了广泛的应用。其中平均孔径35~50 nm的滤膜被称为逆转录酶病毒滤膜。

在实际的生产过程中，为了提高蛋白回收率，需要暂停压力，然后将流路切换到清洗缓冲槽进行后冲洗。病毒过滤的最劣条件之一是高TMP（跨膜压差）。近年来的报告表明，过滤过程中压力的释放及之后的再加压都会影响病毒去除效果。特别是在添加细小病毒和噬菌体进行的实验中，在压力暂停后再次加压，会从滤液中检测出病毒粒子。这种现象不是某种病毒滤膜所特有的，而是所有病毒滤膜产品的普遍现象。发生这种现象的原因在于，暂停压力后，被截留在膜内的病毒粒子会再进行布朗运动，离开膜壁，再次加压后，附近若有粒径较大的滤孔，病毒粒子又会通过而漏出膜外。当然，这不意味着病毒粒子一定会漏出。病毒漏出与否、漏出量取决于过滤对象溶液的性质、过滤压力、压力暂停时间、病毒种类、病毒滴度/量和病毒滤膜的种类。咨询电话: 13816144967 (微信同号)